北京協和醫院發布-新型冠狀病毒的核酸檢測流程

北京協和醫院發布了新型冠狀病毒核酸檢測標準操作流程（文末有協和醫院發布詳細文章及視頻連接）

樣本的核酸提取

A、手工核酸提取操作流程（以凱杰的52906柱提法核酸提取試劑盒為例）

       （1）裂解液配制：在基因擴增實驗室的試劑配制區或單獨的普通試劑配制實驗室中，準備核酸提取所需的洗液1（AW1）、洗液2（AW2）和carrier RNA。按照要求，分別向洗液1和洗液2中加入分子生物學級別的130ml和160ml的無水乙醇并及時做好標記；取310μl洗脫液（AVE）溶解310μg/支的Carrier RNA。配置好后，通過傳遞窗進入核酸提取區或由工作人員送入核酸提取專用實驗室。

       （2）樣本裂解：取560μl AVL裂解液到1.5ml無菌EP管中，加入5.6μl配制好的Carrier RNA，再加入已經滅活的140μl樣本（例如咽拭子、血漿等），混勻振蕩15秒，室溫靜置10分鐘，充分裂解樣本中的核酸。將EP管瞬時離心后加入560μl無水乙醇，充分混勻15秒，再次瞬時離心后備用。吸取630μl裂解產物，小心加入至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘，轉移離心柱至新收集管，將剩余630μl裂解產物加到離心柱中，重復上一離心操作（若樣本體積大于140μl，則在此步驟重復將630μl裂解產物過濾收集在一個離心柱上）。

       （3）核酸的洗滌：取500μl洗液1（AW1）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，取500μl洗液2（AW2）至離心柱中，8000rpm（或6000g）離心1分鐘；換新收集管后，用14000rpm（或20000g）離心3分鐘，去除洗液2（AW2）；換新收集管后，繼續用離心機最大轉速（20000g）離心1分鐘，充分甩離殘留的洗液2（AW2）。

       （4）核酸的洗脫和回收：取一1.5ml無菌EP管，將離心柱放入其中，加入洗脫液（AVE）40~60μl，室溫靜置1分鐘后，用8000rpm離心1分鐘回收核酸，以備PCR檢測使用。

2.要點提示：

       ●新鮮裂解液的配制應盡可能在專門的潔凈區域或單獨的實驗室進行。

       ●要用分子生物學級別的無水乙醇試劑進行配制。

       ●向離心柱中加入裂解產物、洗液時操作要非常小心，盡量將洗頭下探到離心柱內部后靠管壁加樣，切忌出現溢灑后污染到離心柱的密封圈，這可能會導致乙醇殘留，抑制后續PCR反應。離心操作時盡量選擇支持生物安全的離心機（例如廣州吉迪儀器有限公司生產JIDI-18H或JIDI-18RH）

       ●從離心機中取出離心柱時應小心操作，避免離心柱下緣被收集管中的濾過殘液污染。

       ●加入洗液2（AW2）后的第二次空管全速離心非常關鍵，能幫助充分甩離離心柱濾膜中殘留的洗液2殘液，確保洗脫核酸的純度。

       ●洗脫液加樣時需小心操作，確保洗脫液盡可能覆蓋全部離心柱濾膜，充分洗脫核酸，提高核酸提取的產量。

       ●手工核酸提取可優選使用檢測試劑盒說明書推薦的配套手工提取試劑，也可選用通用手工提取試劑。

       ●樣本處理過程中，工作人員覺得有必要時，應隨時更換新的外層乳膠手套。

       B、采用核酸提取儀提取核酸的操作流程

       根據核酸提取儀和試劑的說明書準備好提取試劑，取200μl樣本上機提取核酸，并按照要求回收提取好的核酸備用。

       2.要點提示：

       ●不同的提取儀器和試劑的提取效率可能存在差異，請一定嚴格按照提取試劑盒的說明書進行核酸提取操作。

       ●有條件時可以考慮配備小型化的核酸提取儀在安全柜內使用，以進一步加強生物安全防護；若使用在安全柜外的核酸提取儀，則一定要做好生物安全防護及樣本的防污染保護。